Năm 1991, siêu chiến binh James "Bucky" Barnes bị tẩy não và tra tấn tại một khu căn cứ của Hydra tại Siberia để đánh chặn một vụ vận chuyển mẫu huyết thanh siêu chiến binh. Ở thời điểm hiện tại, khoảng một năm sau sự thất bại của Ultron dưới tay Biệt đội Avengers tại Sokovia, Steve Rogers, Natasha Romanoff, Sam Wilson và Wanda Maximoff đã ngăn chặn một nhóm khủng bố do Brock Rumlow (Crossbones) cầm đầu nhằm ăn cắp vũ khí sinh học từ một phòng thí nghiệm ở Lagos, Nigeria. Sau khi bị đánh bại, Rumlow kích nổ bom cảm tử trên người. Wanda vội đưa hắn vào một toà nhà, nhưng vô tình giết chết một vài nhân viên cứu trợ của Wakanda ở trong.

Bộ trưởng Ngoại giao Hoa Kỳ Thaddeus "Thunderbolt" Ross thông báo tới nhóm Avengers rằng Liên Hợp Quốc đang trong quá trình thông qua Hiệp định Sokovia, trong đó các siêu anh hùng phải đăng ký danh tính với chính phủ để chính phủ có thể theo dõi và điều chỉnh hoạt động của tất cả các siêu anh hùng. Biệt đội Avengers chia ra làm hai luồng ý kiến: Tony Stark đồng ý với sự giám sát bởi vì anh cảm thấy có lỗi khi tạo ra Ultron, gây nên sự kiện kinh hoàng tại Sokovia khiến một thường dân thiệt mạng - hậu quả mà chính anh vừa mới biết, trong khi Rogers không tin tưởng vào chính phủ và mong muốn nhóm của anh vẫn có thể được tự do hành động. Chỉ riêng Wanda còn do dự. Trong lúc đó, Helmut Zemo, cựu chỉ huy tình báo Sokovia, theo dấu và sát hại kẻ đã kiểm soát Barnes ở HYDRA, đánh cắp cuốn sách ghi chú mật mã kích hoạt quá trình tẩy não Chiến binh Mùa Đông. Tại hội nghị ký kết Hiệp định diễn ra ở Vienna, một vụ đánh bom khủng bố đã giết chết Đức vua T'Chaka của Wakanda. Khi camera an ninh cho thấy thủ phạm là Barnes, con trai của T'Chaka là T'Challa thề sẽ trả thù cho cha. Bất chấp những lời khuyên của Romanoff, Rogers và Wilson quyết định theo dõi Barnes đến nơi ẩn náu của anh ở Bucharest và cố gắng bảo vệ anh khỏi cảnh sát và T'Challa. Sau một cuộc rượt đuổi kéo dài, Barnes bị bắt, còn Rogers, Wilson và T'Challa bị bắt giữ vì cản trở công lý.

Khi Barnes bị giam cầm ở Berlin, Zemo, với tư cách là người thẩm vấn Barnes, đã sử dụng mật mã kích hoạt của HYDRA, khiến cho Barnes phải phục tùng hắn. Rogers và Wilson đến để ngăn chặn và đưa Barnes đi. Sau khi đã tỉnh lại, Barnes nói với Rogers rằng Zemo muốn biết địa điểm của căn cứ HYDRA tại Syberia, nơi các Chiến binh Mùa đông khác (được tạo nên bằng các mẫu huyết thanh bị lấy cắp, mạnh hơn nhưng tâm lý bất ổn hơn Barnes) đang bị giam giữ. Nhằm bắt giữ Zemo, Rogers và Wilson tập hợp Wanda Maximoff, Clint Barton, và Scott Lang để giúp đỡ mình. Với sự đồng ý từ Ross, Stark tập hợp Romanoff, T'Challa, James Rhodes, Vision và Peter Parker, đánh chặn nhóm của Rogers tại sân bay Leipzig/Halle. Một cuộc chiến nảy lửa giữa hai đội xảy ra sau đó, cho tới khi Romanoff để cho Rogers và Barnes chạy thoát bằng chiếc máy bay Quinjet, trong khi những người còn lại của đội Rogers bị đánh bại và bị đưa tới giam giữ tại nhà tù Raft. Rhodes bị chấn thương cột sống nghiêm trọng dẫn đến liệt chân sau khi bị Vision bắn nhầm, còn Romanoff thì đã rời đi sau những lời chất vấn thái độ ích kỷ của Stark.

Zemo cố tình để lại những bằng chứng, kể cả thi thể của người thẩm vấn thực sự, nhằm tự thú mình là thủ phạm đánh bom tại Vienna và khống chế Barnes. Hay tin, Stark dùng chúng để thuyết phục Wilson cho anh biết vị trí của Rogers. Stark đã đuổi theo Rogers và Barnes đến Siberia mà không hề báo lại với Ross, và anh cũng không hề hay biết rằng T'Challa đang bám theo mình. Họ phát hiện ra rằng những Chiến binh Mùa đông khác đã bị Zemo sát hại. Zemo cho Stark xem một đoạn video an ninh từ năm 1991, tiết lộ Barnes chính là sát thủ đã giết cha mẹ của Stark để ăn cắp mẫu huyết thanh siêu chiến binh từ chiếc xe của họ. Cảm thấy bị phản bội, Stark nổi điên lao vào đòi giết Barnes, còn Rogers thì cố gắng bênh vực người bạn cũ dù đã không sớm kể cho Stark. Barnes mất cánh tay máy của mình trong cuộc chiến, và Rogers vô hiệu hóa được bộ giáp Mark XLVI của Stark. Rogers dìu Barnes bỏ đi, và để lại chiếc khiên đằng sau mình sau khi Stark cho rằng anh không xứng đáng với nó. Hài lòng khi đạt được mục đích trả thù cho cái chết của gia đình trong cuộc tấn công ở Sokovia bằng cách gây rạn nứt Biệt đội Avengers từ bên trong, Zemo định tự kết liễu đời mình, nhưng T'Challa đã ngăn hắn lại và bắt hắn đưa về.

Sau cuộc chiến, Stark cung cấp cho Rhodes một đôi chân máy để hồi phục chấn thương, còn Rogers thì đột nhập và giải cứu đồng đội của mình ra khỏi nhà tù Raft sau khi gửi cho Stark bưu phẩm chứa điện thoại liên lạc riêng và thư hòa giải kèm đề nghị làm ngơ cho mình. Ở đoạn mid-credits, Barnes đang ẩn thân tại Wakanda, và anh quyết định sẽ ngủ đông cho đến khi phương pháp chữa trị tẩy não được tìm ra. Trong đoạn post-credits, Peter Parker trở về nhà tại Queens, New York và mày mò chiếc máy bắn tơ mà Tony Stark chế tạo riêng cho cậu.